受質層次磷酸化是細胞內的一個重要調節機制，通過在蛋白質上添加磷酸基團來改變其活性或功能。這種化學修飾可以影響蛋白質的結構，從而調節其參與的生物過程。如在糖解作用上，葡萄糖分解成丙酮酸的過程中，會產生帶有磷酸基的中間產物磷酸烯醇丙酮酸（PEP），再經酵素的催化，將此中間產物的磷酸基轉移給 ADP，生成ATP。在此過程中，磷酸基是來自酵素的受質，即為受質層次磷酸化。
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